ISSN-e: 3006-9467; ISSN: 0016-7975 / 1011-9565

GEOMINAS, Vol. 50, N° 87, abril 2021

Agronomy/Agronomía/Agronomia

Comparación entre los diferentes polimorfos de lisozima Hwel en base a las interacciones intermoleculares

Comparison between the different Hwel lysozyme polymorphs based on intermolecular interactions

Comparação entre os diferentes polimorfos lysozyme Hwel baseados em interações intermoleculares

Eduardo Chalbaud

Bio°, Msc. Universidad de Los Andes (ULA). https://orcid.org/0000-0002-1567-8151 Correo-e: chalbaud.eduardo09@gmail.com

Graciela Díaz de Delgado

Quím°, Dra. ULA. https://orcid.org/0000-0001-5511-4230. Correo-e: carlota.diaz.delgado@gmail.com

José A. Gavira

Quím°, Dr. Universidad de Granada. Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). https://orcid.org/0000-0002-7386-6484. Correo-e: jgavira@ugr.es

Leticia Mogollón

Fis°, Dra. Universidad Politécnica Territorial de Mérida Kléber Ramírez (UPTMKR). https://orcid.org/0000-0002-5129-1966. Correo-e: leticiamogollon@gmail.com

Este trabajo fue presentado en el:

Abstract

HWEL lysozyme is an enzyme of the glycosihydrolase type, composed of 129 amino acids organized into domains of α-helices and β-sheets with an antiparallel configuration. So far, his crystallographic studies have shown that it crystallizes in at least five types of crystal symmetry (triclinic, monoclinic, orthorhombic, tetragonal and hexagonal) established by the crystal growth conditions: pH (4.8 and 8.0), temperatures from 285 K to 300 K and pressure from 1 atm to 100 atm) and the crystallizing agents (I-, NO3-, Br-, Cl-, CH3CO2- & H2PO4-). Using the Protein Data Base (PDB) and the dr_sasa and AMBER programs, a comparative analysis of the five crystallographic morphologies was carried out, calculating the distances between the crystallizing agents - the protein and the crystallizing agents - water molecules smaller than 4 Å, and the density of water molecules associated with protein structures; to determine the specific contact areas of the molecules, and the Coulombine interaction forces of each interacting atom. Demonstrating that there are specific amino acid residues and crystallizing agents for each type of interaction, and according to the density of water molecules and the combination of the types of interactions, the order of crystallographic symmetry is established.

Resumen

La lisozima HWEL es una enzima del tipo glicosihidrolasas, compuesta por 129 aminoácidos organizados en dominios de hélices-α y láminas-β de configuración antiparalelas. Hasta el momento, sus estudios cristalográficos demostrado que cristaliza en al menos cinco tipos de simetría cristalinas (triclínico, monoclínico, ortorrómbico, tetragonal y hexagonal) establecidas por las condiciones de crecimiento de cristales: pH (4,8 y 8,0), temperaturas de 285 K a 300 K y presión de 1 atm a 100 atm) y los agentes cristalizantes (I-, NO3-, Br-, Cl-, CH3CO2- ÿ H2PO4-). Utilizando la Base de Datos de Proteína (PDB) y los programas dr_sasa y AMBER se realizó un análisis comparativo de las cinco morfologías cristalográficas, calculando las distancias entre los agentes cristalizantes - la proteína y los agentes cristalizantes -moléculas de agua menores a 4 Å, y la densidad de moléculas de agua asociadas a las estructuras proteicas; para determinar las áreas específicas de contacto de las moléculas, y las fuerzas de interacción Coulombinas de cada átomo que interactúa. Demostrándose que existen residuos de aminoácidos y agentes cristalizantes específicos para cada tipo de interacción, y según la densidad de moléculas de agua y la combinación del tipos de interacciones se establece el orden de la simetría cristalográfica.

Resumo

A lisozima HWEL é uma enzima do tipo glicosihidrolase, composta por 129 aminoácidos organizados em domínios de α-hélices e β-folhas com configuração antiparalela. Até agora, seus estudos cristalográficos mostraram que ele cristaliza em pelo menos cinco tipos de simetria cristalina (triclínica, monoclínica, ortorrômbica, tetragonal e hexagonal) estabelecida pelas condições de crescimento do cristal: pH (4,8 e 8,0), temperaturas de 285 K a 300 K e pressão de 1 atm a 100 atm) e os agentes cristalizantes (I-, NO3-, Br-, Cl-, CH3CO2- ÿ H2PO4-). Utilizando o Protein Data Base (PDB) e os programas dr_sasa e AMBER, foi realizada uma análise comparativa das cinco morfologias cristalográficas, calculando as distâncias entre os agentes cristalizadores - a proteína e os agentes cristalizantes - moléculas de água menores que 4 Å, e a densidade das moléculas de água associadas às estruturas das proteínas; determinar as áreas específicas de contato das moléculas e as forças de interação de Coulombine de cada átomo em interação. Demonstrando que existem resíduos de aminoácidos e agentes cristalizadores específicos para cada tipo de interação, e de acordo com a densidade das moléculas de água e a combinação dos tipos de interações, estabelece-se a ordem de simetria cristalográfica.

Palabras clave/Keywords/Palabras-chave:

Forças de interação, fuerzas de interacción, HEWL, interaction forces, polimorfos, polymorphs.

Citar así/Cite like this/Citação assim: Chalbaud et al. (2022) o (Chalbaud et al., 2022).

Referenciar así/Reference like this/Referência como esta:

Chalbaud, E., Díaz, G., Gavira, J. A.,Mogollón, L. (2022, abril). Comparación entre los diferentes polimorfos de lisozima Hwel en base a las interacciones intermoleculares. Geominas 50(87). 17-20.

Introducción

Las proteínas son macromoléculas biológicas esenciales en las células, que muestran una alta complejidad en composición y estructura, debido a la naturaleza del enlace peptídico, involucrado en la polimerización de sus monómeros bioquímicos (aminoácidos), en un orden especifico conformando la cadena peptídica, que bajo las condiciones del ambiente químico en que se encuentre se ordena espacialmente tomando diferentes niveles de organización, y en relación a la estructura que tomo se establece su función celular; así como puede variar su solubilidad y bajo ciertas condiciones llega a cristalizar [1].

La cristalización de proteínas se rige por la naturaleza de sus moléculas, los agentes cristalizantes y las moléculas de agua que la acompañan. Estos factores se modulan por los contactos intermoleculares o macro-enlaces en la red cristalina, que son la suma de diferentes tipos de enlaces no covalentes que conducen a una fuerte atracción para establecer la interfaz cristal/disolvente; lo que conforma la superficie del cristal, incluida la superficie de los poros interior, conformándose en tres dimensiones áreas específicas de la superficie de las proteínas para cada tipo de red cristalina [2]. Un ejemplo de cómo estos macro-enlaces modulan los polimorfismos está presente en la enzima lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL), conformada por 129 aminoácidos con una estructura globular basada en dominios de hélices α y láminas β en anti-paralelo que ha sido altamente estudiada en sus procesos de crecimiento. Esta proteína cristaliza en cinco sistemas cristalinos diferentes: hexagonal, tetragonal, ortorrómbico (2x), monoclínico (2x) y triclínico, determinadas mediante Difracción de Rayos X de cristal único [3,4].

A partir de las estructuras cristalinas conocidas, es posible investigar las especificidades de las interacciones intermoleculares, constituidas por interacciones de hidrógeno, iónicas y de van der Waals. Han sido estudiadas ampliamente cuatro de estas simetrías en la HEWL [3,2,5], logrando estimar las resistencias de los macro-enlaces en cada celda unidad. Estos macro-enlaces forman cadenas de enlaces periódicas (PBC; [6]) que controlan la morfología general de toda la estructura cristalina, a pesar de ser fuerzas de interacción intermolecular muy débiles y complejas, estudios demuestran que existe una correlación entre estos y la generación de polimorfismos estructurales de la proteína. En este artículo, haremos una descripción comparativa del rol de los contactos intermoleculares en las diferentes simetrías de la HEWL.

Procedimientos

Siguiendo el trabajo de Matsura y Chenov (), se tomaron las coordenadas de los átomos de HEWL presentes en la base de datos de proteína (siglas en ingles PDB; [7]) para Hexagonal (código PDB 2fbb), tetragonal (193l), Ortorrómbicos como Ortorrómbica de alta temperatura (siglas en inglés HTO; código PDB 1HSX) y Ortorrómbica de baja temperatura (siglas en inglés LTO, código PDB 1bgi), Monoclínicos como Monoclínico de una proteína por dominio (código PDB 1lma) y Monoclínico de dos proteínas por dominio (código PDB 1hf4) y Triclínica (código PDB 2lzt). Los grupos espaciales y parámetros de la celda unitaria para estos diferentes polimorfos de HEWL se muestran en la tabla 1.

Luego, con las herramientas del CCP4[8]: NCONT (calcula varios tipos de contactos en estructuras de proteínas), PISA (Interfaces, superficies y ensamblajes de proteínas) y LSQKAB (trabaja y aplica varias transformaciones para coordinar archivos), se analizaron los contactos entre subconjuntos de átomos para cada polimorfo de HEWL estableciendo el número de enlaces entre ligando y proteína a menos de 4,00 Å, los tipos de ensamblajes de la proteína y comparar por superposición las estructuras de cada polimorfo. A su vez para estimar el área de la superficie de contactos de las moléculas en cada macro-enlace se calcularon las áreas de superficie expuesta de los átomos en la molécula libre usando el programa dr_SASA [9].

Resultado y discusión

El análisis a cada polimorfo de HEWL según los cinco sistema cristalográfico, mostró que la proteína según la red cristalina esta como monómero o dímero en el motivo, varían en la cantidad de moléculas de agua así como de solvente, como se ve en la tabla 1. Comparando todas las simetrías cristalinas de HEWL, la celda unidad correspondiente al sistema Monoclínico con dímeros, exhibe el mayor contenido de agua (251,00 moléculas de H2O) para Triclínico (249,00 moléculas de H2O); monoclínica monómera (148,00 moléculas de H2O); ortorrómbica LOW (152,00 moléculas de H2O); ortorrómbica HTO (110,00 moléculas de H2O); tetragonal, (142,00 moléculas de H2O) y hexagonal (165,00 moléculas de H2O); y cada simetría mostro tener diferentes números de contactos intermoleculares (Triclínico 12; Monoclínica monómera seis; Monoclínica dímera 33; Ortorrómbica LOW seis; Ortorrómbica HTO cinco; Tetragonal, seis; Hexagonal, 56).

Tabla 1. Datos cristalográficos de los diferentes polimorfos de la lisozima HEWL.

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Resultado y discusión

La tabla 2 se enumera los R.M.S. (desviación de la media cuadrada), valores del desplazamiento de las coordenadas para los átomos de Cα para las estructuras tetragonal, ortorrómbicas, monoclínicas, triclínica y hexagonal (comparación por superposición en función a la hexagonal, ver figura 1). Las desviaciones principales están determinadas por las diferencias de las tres regiones de bucle flexible definidas por los residuos 45–50, 68–73 y 97–104. La región 97-104 claramente diferenciada en comparación con todas las formas de cristalinas; a su vez las formas Ortorrómbica LOW y Monoclínica monómera comparten mayor similitud con la forma Hexagonal, al igual que los polimorfos Tetragonal y Triclínico.

Tabla 2. Superposición estructural de HEWL en sus diferentes formas cristalinas (estructuras triclínica, monoclínica, ortorrómbica, tetragonal y hexagonal.

Tcl, Triclinico (P1), Mcl, Monoclínico (P21), Mcl1 (Mcl monómero), Mcl2A (dímero A), Mcl2B (dímeroB), Ort, Ortorrómbico (P212121), OrtLOW (Ort LOW), OrtHOT (Ort HOT). Tet, Tetragonal (P43212) y Hex, Hexagonal (P6122). R.M.S., desviaciones media cuadrada basándose en los 129 pares Cα superpuestos.

Este tipo de evidencia de similitud y al comparar los parámetros de celdas entre polimorfos de HEWL nos refleja la relación entre empaquetamientos y la existencia de superestructuras o estructuras moduladas conmensurables, que derivan de aquellas en las que al menos uno de sus parámetros es un múltiplo entero de uno de los parámetros de la celda unidad del arreglo sencillo o subestructuras.

Figura 1. Superposición Cα de las diferentes simetrías cristalinas de HEWL (estructuras Triclínica, Monoclínica, Ortorrómbica y Tetragonal sobre la Hexagonal [3]. Los cálculos se realizaron utilizando el programa LSQKAB [8].

Conclusión

En principio, la conformación de la proteína HEWL en diferentes empaquetamientos es altamente similar y solo surgen diferencias significativas en las regiones de bucle, estructuras secundarias irregulares de gran flexibilidad.

Referencias

[1].Voet, Donald, Charlotte W. Pratt, and Judith G. Voet. (USA). Voet's Principles of biochemistry. Wileym (2016).

[2].Oki, H., Matsuura, Y., Komatsu, H. & Chernov, A. A. (1999). Acta Cryst. D55, 114-121.

[3].Brinkmann, C., Weiss, M. S. & Weckert, E. (2006). Acta Cryst. D62, 349-355.

[4].Matsuura, Y. & Chernov, A. A. (2003). Acta Cryst. D59, 1347-1356.

[5].Hondoh, H., Sazaki, G., Miyashita, S., Durbin, S. D., Nakajima, K. & Matsuura, Y. (2001). Cryst. Growth Des. 1, 327–332.

[6].Hartman, P. (1973). Crystal Growth: An Introduction, edited by P. Hartman, ch. 14. Amsterdam: North-Holland

[7].Berman HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H, Shindyalov IN, Bourne PE. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 2000 Jan 1;28(1):235-42.

[8].J. Ribeiro, C. Ríos-Vera, F. Melo, and A. Schüller (2019), Calculation of accurate interatomic contact surface areas for the quantitative analysis of non-bonded molecular interactions. Bioinformatics, 35 (18), 3499-3501

[9].Collaborative Computational Project, Number 4 (1994). Acta Cryst. D50, 760-763.

[10] Buerger, M. (1947). Derivative crystal structures. J. Chem. Phys. 15:1 1-16.

The author(s) declare(s) that she/he/they has/have no conflict of interest related to hers/his/their publication(s), furthermore, the research reported in the article was carried out following ethical standards, likewise, the data used in the studies can be requested from the author(s), in the same way, all authors have contributed equally to this work, finally, we have read and understood the Declaration of Ethics and Malpractices.

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